细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)是一类具有细胞膜穿透才智的多肽，不错手脚药物载体佩带大分子物资干涉细胞，其因低毒性和多组织普适性平日诈骗于医学成像和和谐的研究中。主见 构建穿膜肽钴原卟啉药物复合体(R6-CoPP)，研究其生物相容性和削弱晶状体上皮细胞氧化应激毁伤的作用。法式 遴选Fmoc固迎合成法，证明筹谋的序列合成寡聚精氨酸穿膜肽(R6)，以脱水缩正当将其与钴原卟啉(cobalt protoporphyrin，CoPP)衔尾，使用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)进行符号。应用高效液相色谱仪和质谱仪测定其纯度和相对分子质料，利用扫描透射电镜(STEM)能谱面/线扫和激光纳米粒度电位测量仪不雅测其表征描绘、元素散播、粒子直径和名义电位；细胞流式仪和共聚焦显微镜不雅察R6-CoPP对体外培养的东谈主晶状体上皮细胞系的穿膜恶果；CCK-8法检测R6-CoPP对东谈主晶状体上皮细胞系细胞活性的影响。利用H2O2构建晶状体上皮细胞氧化毁伤模子，比较R6-CoPP与CoPP预处分对细胞凋一火的影响。 截止 经高效液相色谱法坚强R6-CoPP纯度为94.56%，质谱坚强相对分子质料为2109.75，与预测相符，粒径为227.8 nm，名义电位为 +13.9 mV，STEM能谱面扫暴露R6-CoPP内有钴元素散播。R6-CoPP对细胞毒性较小，生物相容性好。细胞流式截止暴露穿膜肽药物孵育细胞2 h后荧光阳性细胞比例可达80%以上。共聚焦显微镜荧光暴露孵育15 min后R6-CoPP一经穿越细胞膜干涉细胞质，细胞荧光强度随孵育时代的加多而下跌。与氧化毁伤模子组比较，CoPP和R6-CoPP预处分后的细胞存活率彰着提升(P＜0.05)。论断 穿膜肽药物复合体R6-CoPP生物相容性较好，具有较强的细胞膜穿透才智，体外实验暴露其可削弱氧化毁伤所致的晶状体上皮细胞凋一火。

重要词 ： 穿膜肽；血红素氧合酶1；抗氧化应激；东谈主晶状体上皮细胞；细胞凋一火

活着界范围内，年纪关系性白内障(age-related cataract，ARC)是患病率最高的致盲性眼病，大众50岁以上的东谈主群中有9%的患者因为白内障而丧失见解[1]。因此研究梗概禁绝白内障造成并减缓其发展的药物具有紧迫的临床价值。ARC的发病机制当今尚不解确，但氧化应激介导的晶状体上皮细胞 (human lens epithelial cells，LECs)凋一火与其发生发展密切关系[2]。血红素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)是体内散播最平日的抗氧化酶之一，已有研究解释其在细胞的氧化应激毁伤历程中有紧迫的保护作用[3-4]。本课题组前期研究发现HO-1激活剂钴原卟啉(cobalt protoporphyrin，CoPP)不错通过下调活性氧，上调收复性谷胱甘肽和超氧化物歧化酶等抗氧化应激酶的含量，禁绝H2O2提醒的东谈主LECs凋一火[5]。但一些大分子药物很难通过局部滴眼液或口服药物在眼内达到顺应和谐浓度[6]。细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)是一类不需要依赖受体，不错径直穿过细胞膜的多肽[7]。这类多肽不错佩带生物活性物资干涉细胞和组织，其低毒性和多组织普适性使之成为优良的药物载体[8]。有文件报谈使用穿膜肽融合雷珠单抗局部滴眼给药手脚玻璃体注药的替代疗法和谐条理膜重生血管[9]。因此咱们选用CoPP手脚本研究中穿膜肽佩带的药物。利用东谈主晶状体上皮细胞系(SRA01/04)检测穿膜肽药物复合体R6-CoPP细胞膜穿透恶果和对细胞活性的影响，并比较R6-CoPP与单纯CoPP对LECs氧化毁伤的保护作用。渴望梗概为ARC的药物和谐研究提供新的法式和想路。

1 R6-CoPP 的制备和表征锤真金不怕火 参考 Cogan 等[9]的实验法式采用阳离子穿膜肽中穿膜才智较强的寡聚精氨酸R6(RRRRRR)，添加赖氨酸(K)踏实产品结构，利用脱水缩合的旨趣将其与CoPP衔尾，临了添加FITC荧光符号，序列为CoPP-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Lys(5-FITC)。使用9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，Fmoc)固迎合成法合成R6-CoPP，产品的合成及纯化由上海强耀生物科技有限公司协助。简述门径如下：将树脂溶胀后加入Fmoc-Lys(Dde)-OH手脚首位氨基酸，甲醇溶液封尾，20%哌啶DMF溶液脱保护后使用HBTU和DIEA手脚缩合剂，DMF手脚活化剂，按照从Lys到Arg的规矩治安衔尾序列中的氨基酸，直至临了衔尾CoPP，使CoPP的羧基立时与Arg残基中的氨基进行缩合反映，去掉Lys侧链保护后加入5-FITC衔尾。切割液切割后用乙醚析出干燥后取得粗产品，利用反相色谱制备系统提纯。临了使用HPLC分析仪和质谱仪(MS)检测并计较纯化后产品的纯度和相对分子质料。高效液相色谱参数：Kromasil 100-5C18，30℃，流动相A为0.1% TFA + 乙腈，流动相B为0.1%TFA + 纯水，梯度流速 1.0 mL/min，检测波长220 nm。质谱参数：电喷雾 (ESI)，电压 4.5 kV±，雾化器(NEB)12.0，帘气(CUR)6.0。冻干产品加入去离子纯水制备成知道溶液，稀释后用激光纳米粒度测量仪和Zeta名义电位测量仪对产品进行检测。滴加R6-CoPP溶液于铜网复旧膜上，干燥后遴选透射电镜进行成像。利用扫描透射高角环形暗场 (high angle annular dark field，STEM-HAADF)成像期间进行EDS面扫和线扫[10]。不雅测穿膜肽复合物的粒子描绘和钴元素散播表征。

2 细胞培养 SRA01/04 东谈主晶状体上皮细胞系 (LECs)购于广州赛库生物期间有限公司。LECs细胞培养使用含有10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM高糖培养基。培养箱缔造为37℃、5% CO2。细胞复苏后逐日镜下不雅察细胞形态，会怒放到80%独揽时按1∶3进行传代。传代3 ~ 5次后，取对数滋始终的细胞进行施行。

3 R6-CoPP 的细胞毒性检测 以 3 × 103/孔的细胞密度将LECs接种于96孔板，在培养箱中培养过夜，使细胞贴壁舒展。将细胞分为对照组和R6-CoPP处分组，对照组不加入药物正常培养，R6-CoPP 组分辩加入浓度为 20 µg/mL、40 µg/mL、80 µg/mL、100 µg/mL 的 R6-CoPP，每组 3 个复孔。培养24 h后PBS清洗细胞3次，将CCK-8与培养基按1∶10的比例搀和为CCK-8责任液，每孔加入110 µL的责任液，置于培养箱内接续培养2 h后用酶标仪测量各孔在450 nm波所长的吸光度值。证明各组的吸光度值，以对照组为参照计较细胞存活率。细胞存活率在75% ~ 100%区间内证明材料的细胞毒性低，生物相容性精致。

4 细胞流式仪检测 R6-CoPP 的穿膜才智 以 3 ×104/孔的细胞密度将LECs接种于6孔板，培养箱培养过夜后分辩更换浓度为 10 µg/mL、20 µg/mL、40 µg/mL 的 FITC 符号的 R6-CoPP 孵育 2 h，吸去培养基，PBS洗涤3次，0.25%胰卵白酶消化、集中细胞，流式细胞仪上机分析荧光阳性细胞比例。

5 共聚焦显微镜不雅察 R6-CoPP 在细胞内的定位以 5 × 103/孔的细胞密度将 LECs 接种于 35 mm共聚焦培养皿中，在培养箱培养过夜，镜下搜检细胞贴壁舒展后，更换R6-CoPP浓度为20 µg/mL的培养基孵育 0.25 h、3 h、6 h、24 h，以未加药培养的细胞手脚对照组，PBS洗涤3次后每皿加入1 mL的4%多聚甲醛常温下固定细胞20 min。固定完成后PBS洗涤3次，每皿加入1 ~ 2滴含DNA结合染料DAPI的甘油封片剂，激光共聚焦显微镜不雅察拍照。

6 R6-CoPP 体外抗氧化应激毁伤恶果评价 以3 × 103/孔的细胞密度将LECs接种于96孔板，在培养箱中培养过夜，实验组分辩加入H2O2浓度为200 µmol/L、400 µmol/L、600 µmol/L 的培养基培养24 h，对照组仅换液，每组3个复孔。培养实现后用CCK-8试剂盒检测各组细胞的存活率，采用存活率＜50%的浓度用于后续的实验。药物预处分细胞24 h后更换含有H2O2的培养基孵育24 h构建细胞氧化毁伤模子[5，11]。细胞处分同前。将细胞立时辰组：对照组，填塞培养基培养48 h；H2O2氧化毁伤模子组，填塞培养基培养24 h后更换 H2O2浓度 600 µmol/L 的培养基培养 24 h；CoPP预处分组，CoPP浓度为10 µmol/L的培养基培养 24 h 后更换 H2O2浓度 600 µmol/L 的培养基培养24 h；R6-CoPP预处分组，R6-CoPP浓度为20 µg/mL 的培养基培养 24 h后更换H2O2浓度600 µmol/L 的培养基培养 24 h。培养实现后用CCK-8法检测各组吸光度并计较各组的细胞存活率。

7 统计学分析 使用 GraphPad Prism 8.0 进行统计学分析，顺应正态散播的计量贵府以 X±s暗意，组间比较遴选只身分方差分析，两两比较遴选Tukey 锤真金不怕火，P＜0.05为各异有统计学意旨。

1 高效液相色谱和质谱坚强 R6-CoPP 证明HPLC色谱图计较得出合成的R6-CoPP主峰彰着，纯度为94.56%，杂质较少，纯度较高。质谱分析截止计较后得出相对分子质料为2109.75，与预测分子量2109.82特地接近，见图1。纳米粒径和名义电位测量仪检测截止见图2，粒径227.8 nm，名义电位 + 13.9 mV。名义佩带阳性电荷。透射电镜图像中可不雅察到结构疏松的R6-CoPP多肽颗粒(图3A)，X线能谱元素散播(EDS-Mapping)图像中可见代表钴元素的亮点散播在R6-CoPP中(图3B)，双峰X线断层扫描图可见钴元素弧线(图3C)。

图1 R6-CoPP高效液相色谱分析图和质谱分析图

图2 R6-CoPP的粒径和Zeta电位散播图

图3 R6-CoPP的表征A：R6-CoPP的TEM 图像；

B：R6-CoPP的EDS-Mapping图像，钴元素以纳米级的亮点推崇；

C：HAADF-EDS双峰X线断层扫描期间暴露钴元素散播于纳米颗粒内

2 R6-CoPP 对 LECs细胞活性的影响 使用不同浓度R6-CoPP处分LECs细胞，24 h后对照组以及 R6-CoPP浓度为 20 µg/mL、40 µg/mL、80 µg/mL、100 µg/mL 的细胞存活率分辩为 100.01% ± 3.86%、97.99% ± 2.55%、91.02% ± 12.32%、86.47% ± 9.14%、62.09% ± 2.60%(F=13.17，P＜0.05)。小于 80 µg/mL浓度的处分组比较对照组细胞存活率天然有缩短趋势，但各异无统计学意旨(P＞0.05)。浓度为100 µg/mL处分组细胞存活率小于75%(P＜0.05)。见图4。

图4 不同浓度的穿膜肽药物对LECs细胞活性的影响(aP＜0.05，vs对照组；n=3)

3 的细胞膜穿透才智 流式截止暴露，浓度为10 µg/mL、20 µg/mL、40 µg/mL 的 R6-CoPP 与细胞共耕作2 h后均检测出了较强FITC荧光信号，荧光信号分辩为82.33%±6.25%、89.53%±3.84%、95.80%±1.21%(F=399.4，P＜0.000 1，各异有统计学意旨)。荧光阳性细胞比例跟着浓度的升高递加，不同浓度的R6-CoPP处分组与对照组的荧光阳性细胞比例均有统计学各异(P＜0.05)。R6-CoPP浓度为40 µg/mL处分组的荧光阳性细胞比例大于浓度为 20 µg/mL 和 10 µg/mL 的 R6-CoPP处分组，各异有统计学意旨(P＜0.05，图5)。荧显豁微镜不雅察暴露，孵育15 min后R6-CoPP一经无数干涉细胞，荧光强度较高(图6)。图7中细胞3D图像中可见绿色荧光散播于通盘细胞质，并不局限于细胞膜周围。细胞内的荧光强度跟着孵育时代的加多而下跌，24 h后险些不可见。

图5 不同浓度R6-CoPP孵育2 h后荧光信号阳性细胞比例

(aP＜0.05，vs 对照组；bP＜0.05，vs 10 µg/mL 组，cP＜0.05，vs 20 µg/mL 组；n=3)

图6 R6-CoPP(20 µg/mL)与晶状体上皮细胞孵育不同期间后细胞内的荧光散播(40×，比例尺50 µm)

图7 共聚焦显微镜构建3D图像不雅察R6-CoPP(20 µg/mL)与细胞孵育不同期间后细胞内的荧光散播(40×)

4 R6-CoPP 体外抗氧化应激毁伤恶果 CCK-8 法检测暴露，跟着H2O2浓度的加多，细胞存活率均下跌。H2O2浓度为0 µmol/L、200 µmol/L、400 µmol/L 和600 µmol/L 的细胞存活率分辩为100.21% ± 14.30%、73.99% ± 2.12%、47.69% ± 4.10%、42.98% ± 10.69%(F=24.58，P＜0.0002)，各异有统计学意旨)。当H2O2浓度＞400 µmol/L时细胞存活率＜50%，后续实验采用600 µmol/L的H2O2进行氧化毁伤模子组造模(图8)。对照组、H2O2氧化毁伤模子组、CoPP预处分组、R6-CoPP预处分组的细胞存活率分辩为100.61% ± 1.34%、35.64% ± 2.25%、50.56% ± 1.37%、58.95% ± 1.25%(F=902.9，P＜0.0001，各异有统计学意旨)。与H2O2氧化毁伤模子组比较，R6-CoPP预处分组、CoPP预处分组的细胞存活率显耀提升(P＜0.05)。与CoPP预处分组比较，R6-CoPP预处分组的细胞存活率更高(P＜0.05)。见图9。

图8 不同浓度的H2O2对LECs细胞活性的影响(aP＜0.05，vs 对照组；n=3)

图9 CoPP和R6-CoPP预处分对于H2O2提醒后细胞存活率的影响

(aP＜0.05，vs 对照组；bP＜0.05，vs 模子组；cP＜0.05，vs CoPP预处分组；n=3)

当今对于载药系统的研究多聚首在脂质体和聚壳糖等高分子材料包载药物，通过延迟滴眼液药物在角膜名义的停留时代来增强药物的穿透恶果[12]，而穿膜肽手脚载体利用其穿透特质构建眼部给药系统的研究较少。有很多研究标明穿膜肽的细胞毒性较低，其中阳离子富精氨酸穿膜肽还具有一定的神经保护作用[13]。穿膜肽不错通过共价结合或单纯结合的花式佩带药物，提升药物干涉细胞的才智。Zou等[14]报谈利用穿膜肽佩带药物通过血脑障蔽和谐核心神经疾病。在眼科领域，Gonzalez-Pizarro等[15]利用TAT修饰高分子团聚物纳米粒子(PEG-PLAG)佩带氟米龙干涉眼内，在目下节和眼后段理解抗炎恶果。

本实验中咱们采用寡聚精氨酸R6手脚药物载体，通过脱水缩合的花式将其与CoPP共价结合。经过质谱检测计较合成产品分子质料为2109.75，与预测分子量2109.82接近。而透射电镜和元素弧线分析进一步考证了钴元素与穿膜肽药物的同步

散播，标明药物与穿膜肽得胜衔尾。运载载体名义的正电荷不错与佩带负电荷的细胞膜互相迷惑并结合，通过细胞内吞或融膜作用加多载体转入细胞的效力[7]。寡聚精氨酸是阳离子型穿膜肽，在生理的pH值环境中佩带正电荷，R6-CoPP名义佩带正电荷13.9 mV，略高于Gao等[16]研究中富精氨酸穿膜肽修饰的脂质体类药物的名义电位，洽商因为大部分脂质体类药物佩带有较强的负电荷。天然通过穿膜肽修饰不错缩短或逆转脂质体类药物载体所带负电荷以提升药物的招揽率[16-17]，但载药脂质体的制作工艺更为复杂，且很多研究皆是通过室温孵育，利用分子间的电荷迷惑作用将大分子卵白或载药脂质体与穿膜肽衔尾[9，18]，在衔尾的时候也会产生装载药物泄露的问题。本实验通过脱水缩合的花式在固迎合成的历程中将CoPP上的羧基与穿膜肽游离的氨基衔尾，造成的酰胺键较为踏实，且不错通过检测合成产品的相对分子质料确保药物与穿膜肽衔尾。经细胞体外实验检测R6-CoPP在80 µg/mL浓度下对细胞活性无彰着影响，且与Liu等[19]的聚精氨酸类穿膜肽修饰药物的生物安全浓度周边，生物相容性较好。流式细胞检测截止暴露，在一样的孵育时代，R6-CoPP浓度越高，荧光阳性细胞比例越高，即摄入R6-CoPP的细胞越多，但Zuconelli等[20]的研究发现较高浓度的聚精氨酸类阳离子穿膜肽径直穿过细胞膜干涉细胞时可能会导致细胞内钙离子含量的加多，而晶体里面由于代谢失衡导致的钙离子浓度升高也在白内障的造成中具有一定作用。因此咱们采用较低浓度的20 µg/mL手脚实验浓度。证明共聚焦荧显豁微镜暴露R6-CoPP不错被晶状体上皮细胞继承，且均匀散播于细胞质，具有高效的细胞膜穿透才智。在利用H2O2模拟的LECs氧化毁伤模子中，R6-CoPP推崇出了与CoPP周边的削弱上皮细胞凋一火的作用。由于实验的局限性，只在细胞水平检测了药物的抗氧化毁伤作用，并不可笃定R6-CoPP是否能在体内实验中理解出抗白内障、减缓白内障疾病进展的作用。需要进一步进行体内实验考证。

要而言之，本研究构建了一种穿膜肽药物复合体，细胞相容性较好，具有较强的细胞膜穿透才智，在体外实验中推崇出了一定的抗氧化毁伤作用，给将来的白内障驻防和减速其进展的药物研究提供一定的启发。

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